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生物安全柜的工作原理主要是將柜內空氣向外抽吸，使柜內保持負壓狀態，通過垂直氣流來保護工作人員；外界空氣經高效空氣過濾器過濾后進入安全柜內，以避免處理樣品被污染；柜內的空氣也需經過HEPA過濾器過濾后再排放到大氣中，以保護環境。
生物安全柜有兩個主要目的：防止污染以保護樣品，并保護操作者和實驗環境免受樣品污染。大多數生物安全柜采用過濾器和均勻的氣流，在柜體的外部和內部之間形成一個不可見的屏障。如果功能正常，這將保護樣品不受污染物（如微生物和核酸酶）的影響。
使用生物安全柜時，確保樣品只能遇到無污染的空氣是至關重要的。除了使用過濾器外，您還可以通過盡量減少對生物安全柜的干擾來實現此目的。在開始之前，確保你需要的所有東西都在生物安全柜內部，避免手臂快速移動，因為這可能會引起湍流，從而改變里面的氣流。
生物安全柜使用五大原則：
1、緩慢移動原則：為了避免影響正常的風路狀態，柜內操作時手應該盡量平緩移動。
2、物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現象產生，在柜內擺放的物品應該盡量呈橫向一字擺開，避免回風過程中造成交叉污染。同時避免堵塞背部回風隔柵影響正常風路。
3、避免震動原則：柜內盡量避免震動儀器（例如離心機、旋渦振蕩器等）的使用，因為震動會使得積留在濾膜上的顆粒物質抖落，導致操作室內部潔凈度降低，同時如果在前操作面平衡失敗還會引起安全柜對操作者的污染。
4、不同樣品柜內移動原則：柜內兩種及以上物品需要移動時，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移動原則。
5、明火使用原則：柜內盡量不要使用明火。因為在明火使用過程中產生的細小顆粒雜質將被帶入濾膜區域，這些高溫雜質會損傷濾膜。
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